Alterações funcionais e conformacionais promovidas numa proteinase aspártica por trifluoroetanol

Tese de doutoramento em Bioquímica (Enzimologia), apresentada à Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade de CoimbraO estudo das proteinases aspárticas tem vindo a ganhar interesse devido à importância desta classe de enzimas na etiologia e evolução de doenças humanas que são hoje fonte duma preocupação crescente, como são os casos da doença de Alzheimer, do cancro da mama ou da SIDA. A base molecular de algumas destas doenças está associada a erros de folding (enrolamento), que impossibilitam a sua função. Estudos de estabilidade sobre esta classe de enzimas são de extrema importância para a caracterização dos mecanismos patológicos envolvidos, e para a descoberta de soluções terapêuticas. A proteína heterodimérica cardosina A é uma proteinase aspártica de origem vegetal que pode ser purificada em elevadas quantidades. Apesar de tradicionalmente ser usada como agente coagulante do leite na produção de queijo, as suas características fizeram dela uma enzima interessante para aplicações biotecnológicas. Esta endopeptidase tem sido considerada um bom modelo para estudos estruturais e funcionais do grupo das proteinases aspárticas e de proteínas em geral. A disponibilidade de água é um factor fundamental para a estabilidade proteica e para a sua flexibilidade conformacional, características estas essenciais à sua função. Com o presente trabalho esperamos ter contribuído para a compreensão da conformação nativa das proteinases aspárticas como uma forma mutável. Ao longo dos últimos anos a estrutura conformacional da cardosina A foi caracterizada em sistemas bifásicos, meio aquoso saturado com solventes orgânicos, e mais exaustivamente na presença do solvente orgânico acetonitrilo. Na sequência do trabalho desenvolvido pelo nosso grupo, o unfolding (desenrolamento) da cardosina A foi induzido pelo 2,2,2-trifluoroethanol (TFE), um solvente orgânico polar e prótico com propriedade muito diferentes dos solventes orgânicos previamente usados. As características do TFE promovem alterações distintas na estrutura da água, interagindo de um modo particular com a camada de hidratação da proteína e com a própria estrutura proteica. Além disso o TFE é conhecido por estabilizar conformações complexas em vez de induzir a desnaturação. Foi objectivo do presente trabalho seguir as alterações conformacionais e funcionais promovidas pela proximidade do TFE à estrutura da cardosina A. A dependência da função enzimática em relação à estrutura proteica foi relacionada com a disponibilidade de água e/ou de pontes de hidrogénio na superfície da proteína. Diferentes métodos espectroscópicos (dicroísmo circular e fluorescência intrínseca), medições de actividade enzimática, e análise calorimétrica foram utilizados para detectar e caracterizar os estados induzidos pelo solvente orgânico. Finalmente foram aplicadas ao sistema simulações de dinâmica molecular/mecânica molecular (MD/MM) de forma a compreender a interacção entre a proteína e as moléculas de solvente. Os ensaios in vitro com a cardosina A em TFE promoveram variações de folding dependentes da concentração do álcool. Concentrações de TFE inferiores a 4% diminuíram a estabilidade proteica, mas aumentaram reversivelmente a actividade enzimática. Concentrações superiores a 20% de TFE no meio inactivaram irreversivelmente a enzima e desenrolaram a sua estrutura terciária, enquanto o seu conteúdo secundário em hélices foi progressivamente aumentado (principalmente de segmentos sem estruturação prévia). Por último, concentrações superiores a 70% de TFE no meio inactivaram a enzima e promoveram um vasto aumento na complexidade estrutural, na forma típica de estruturas helicoidais abertas, alterações estas que provaram ser reversíveis. As simulações de MD com TFE e água, descreveram alterações locais de flexibilidade proteica, mas sem grandes transformações conformacionais. Em vez disso o modelo expôs os locais de competição entre o TFE e as moléculas de água da superfície de solvatação. Moléculas de TFE foram encontradas a substituir várias moléculas de hidratação no local activo. Apesar da molécula de água catalítica não ter sido perdida na última conformação adquirida na simulação para alto conteúdo em TFE, o local activo apresentava-se ocupado por várias moléculas de TFE, e este facto foi proposto como justificação para a perda de actividade. A mesma lógica poderá explicar a recuperação de actividade após a diluição para sistema aquoso, com a libertação do local activo para interacção com o substrato.The study of aspartic proteases has been gaining interest due to their importance in the development of major concerning human diseases, as Alzheimer’s disease, breast cancer, or AIDS. The molecular basis of some of these diseases is associated to folding errors, which disables proteins proper functioning. Stability studies over this class of enzymes are extremely important for characterising the pathology involved mechanisms and to discover therapeutic solutions. The heterodimeric cardosin A is a plant aspartic proteinase of high yield purification. Besides having been traditionally used as milk clotting agent for cheese making, its characteristics have made it an interesting enzyme for biotechnological applications. This endopeptidase has thus been considered a good model for structural and functional studies of the aspartic proteinases group, and of proteins in general. Water availability is a fundamental factor for protein stability and conformation flexibility, and these characteristics are imperative for proper functioning. The present approach intends to upgrade the understanding of aspartic proteases native conformation as a mutable form. Along the last few years, cardosin A structural conformation has been characterized in biphasic systems, aqueous solutions saturated by organic solvents, and more extensively in the presence of the organic solvent acetonitrile. In sequence with the work developed by our group, the unfolding of cardosin A was here induced by 2,2,2-trifluoroethanol (TFE), a polar and protic organic solvent with very different properties from the previous organic solvents tested. TFE characteristics promote distinct alterations in water structure, interacting in a particular way with the protein hydration layer and with the protein structure itself. Furthermore, it is known to stabilize well ordered conformations rather than inducing denaturation. The aim of the present work was to follow the conformational and functional alterations promoted by TFE proximity to cardosin A structure. The function dependence on enzyme structure was related to the availability of water and/or of hydrogen bonds to the protein surface. Different spectroscopic methods (circular dichroism and intrinsic fluorescence), activity measurements, and calorimetric analysis were employed to detect and characterize the organic solvent induced states. Finally, molecular dynamics/molecular mechanics (MD/MM) simulations were applied to the system in order to understand the interaction between protein and solvent molecules. The TFE in vitro assays with cardosin A promoted folding variations dependent of the alcohol concentration. TFE medium content below 4% decreased protein stability, but reversibly increased its enzymatic rate. TFE medium content over 20%. irreversibly inactivated the enzyme and unfolded its tertiary structure, while secondary helical content was progressively increased (mainly from previously unordered segments). At last, TFE medium content over 70% inactivated the enzyme and promoted a vast increase in structural complexity, taking form as characteristic open helical structures, and these alterations proved to be reversible. MD simulations with TFE and water described local alterations in protein flexibility, but no large conformational transformations. Instead, the model described an exposition of local competition of TFE with water for solvation surface. TFE molecules were found replacing several hydration molecules in the active site. Despite the catalytic water was not lost in the last acquired conformation of the high TFE content MD simulation, the active site was occupied by several TFE molecules, and this occurrence was proposed to justify the activity loss. The same reasoning can explain the activity recovery upon aqueous dilution, with the release of the active site for substrate binding.Fundação para a Ciência e a Tecnologia, Portugal (projecto POCTI/QUI/60791/2004 e bolsa de doutoramento SFRH/BD/10754/2002

Onychomatricoma on the fourth toenail: a rare tumor in a rare localization

© 2021 Indian Journal of Dermatology, Venereology and Leprology - Published by Scientific Scholar. This is an open-access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution-Non Commercial-Share Alike 4.0 License.Onychomatricoma is a rare benign tumor of the nail matrix, characterized by finger-like projections that invade the nail plate. The fingernails of Caucasian women are most commonly affected. Because this tumor can easily mimic other more prevalent ungual diseases, it is crucial to be acquainted with its characteristic clinical and histopathologic features. The authors present a case of a 40-year-old man with an onychomatrichoma in the fourth left toenail, which was initially misdiagnosed and treated as onychomycosis.info:eu-repo/semantics/publishedVersio

MAGIC and H.E.S.S. detect VHE gamma rays from the blazar OT081 for the first time: a deep multiwavelength study

https://pos.sissa.it/395/815/pdfPublished versio

Mortality from gastrointestinal congenital anomalies at 264 hospitals in 74 low-income, middle-income, and high-income countries: a multicentre, international, prospective cohort study

Summary Background Congenital anomalies are the fifth leading cause of mortality in children younger than 5 years globally. Many gastrointestinal congenital anomalies are fatal without timely access to neonatal surgical care, but few studies have been done on these conditions in low-income and middle-income countries (LMICs). We compared outcomes of the seven most common gastrointestinal congenital anomalies in low-income, middle-income, and high-income countries globally, and identified factors associated with mortality. Methods We did a multicentre, international prospective cohort study of patients younger than 16 years, presenting to hospital for the first time with oesophageal atresia, congenital diaphragmatic hernia, intestinal atresia, gastroschisis, exomphalos, anorectal malformation, and Hirschsprung’s disease. Recruitment was of consecutive patients for a minimum of 1 month between October, 2018, and April, 2019. We collected data on patient demographics, clinical status, interventions, and outcomes using the REDCap platform. Patients were followed up for 30 days after primary intervention, or 30 days after admission if they did not receive an intervention. The primary outcome was all-cause, in-hospital mortality for all conditions combined and each condition individually, stratified by country income status. We did a complete case analysis. Findings We included 3849 patients with 3975 study conditions (560 with oesophageal atresia, 448 with congenital diaphragmatic hernia, 681 with intestinal atresia, 453 with gastroschisis, 325 with exomphalos, 991 with anorectal malformation, and 517 with Hirschsprung’s disease) from 264 hospitals (89 in high-income countries, 166 in middleincome countries, and nine in low-income countries) in 74 countries. Of the 3849 patients, 2231 (58·0%) were male. Median gestational age at birth was 38 weeks (IQR 36–39) and median bodyweight at presentation was 2·8 kg (2·3–3·3). Mortality among all patients was 37 (39·8%) of 93 in low-income countries, 583 (20·4%) of 2860 in middle-income countries, and 50 (5·6%) of 896 in high-income countries (p<0·0001 between all country income groups). Gastroschisis had the greatest difference in mortality between country income strata (nine [90·0%] of ten in lowincome countries, 97 [31·9%] of 304 in middle-income countries, and two [1·4%] of 139 in high-income countries; p≤0·0001 between all country income groups). Factors significantly associated with higher mortality for all patients combined included country income status (low-income vs high-income countries, risk ratio 2·78 [95% CI 1·88–4·11], p<0·0001; middle-income vs high-income countries, 2·11 [1·59–2·79], p<0·0001), sepsis at presentation (1·20 [1·04–1·40], p=0·016), higher American Society of Anesthesiologists (ASA) score at primary intervention (ASA 4–5 vs ASA 1–2, 1·82 [1·40–2·35], p<0·0001; ASA 3 vs ASA 1–2, 1·58, [1·30–1·92], p<0·0001]), surgical safety checklist not used (1·39 [1·02–1·90], p=0·035), and ventilation or parenteral nutrition unavailable when needed (ventilation 1·96, [1·41–2·71], p=0·0001; parenteral nutrition 1·35, [1·05–1·74], p=0·018). Administration of parenteral nutrition (0·61, [0·47–0·79], p=0·0002) and use of a peripherally inserted central catheter (0·65 [0·50–0·86], p=0·0024) or percutaneous central line (0·69 [0·48–1·00], p=0·049) were associated with lower mortality. Interpretation Unacceptable differences in mortality exist for gastrointestinal congenital anomalies between lowincome, middle-income, and high-income countries. Improving access to quality neonatal surgical care in LMICs will be vital to achieve Sustainable Development Goal 3.2 of ending preventable deaths in neonates and children younger than 5 years by 2030

Alterações funcionais e conformacionais promovidas numa proteinase aspártica por trifluoroetanol

Tese de doutoramento em Bioquímica (Enzimologia), apresentada à Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade de CoimbraO estudo das proteinases aspárticas tem vindo a ganhar interesse devido à importância desta classe de enzimas na etiologia e evolução de doenças humanas que são hoje fonte duma preocupação crescente, como são os casos da doença de Alzheimer, do cancro da mama ou da SIDA. A base molecular de algumas destas doenças está associada a erros de folding (enrolamento), que impossibilitam a sua função. Estudos de estabilidade sobre esta classe de enzimas são de extrema importância para a caracterização dos mecanismos patológicos envolvidos, e para a descoberta de soluções terapêuticas. A proteína heterodimérica cardosina A é uma proteinase aspártica de origem vegetal que pode ser purificada em elevadas quantidades. Apesar de tradicionalmente ser usada como agente coagulante do leite na produção de queijo, as suas características fizeram dela uma enzima interessante para aplicações biotecnológicas. Esta endopeptidase tem sido considerada um bom modelo para estudos estruturais e funcionais do grupo das proteinases aspárticas e de proteínas em geral. A disponibilidade de água é um factor fundamental para a estabilidade proteica e para a sua flexibilidade conformacional, características estas essenciais à sua função. Com o presente trabalho esperamos ter contribuído para a compreensão da conformação nativa das proteinases aspárticas como uma forma mutável. Ao longo dos últimos anos a estrutura conformacional da cardosina A foi caracterizada em sistemas bifásicos, meio aquoso saturado com solventes orgânicos, e mais exaustivamente na presença do solvente orgânico acetonitrilo. Na sequência do trabalho desenvolvido pelo nosso grupo, o unfolding (desenrolamento) da cardosina A foi induzido pelo 2,2,2-trifluoroethanol (TFE), um solvente orgânico polar e prótico com propriedade muito diferentes dos solventes orgânicos previamente usados. As características do TFE promovem alterações distintas na estrutura da água, interagindo de um modo particular com a camada de hidratação da proteína e com a própria estrutura proteica. Além disso o TFE é conhecido por estabilizar conformações complexas em vez de induzir a desnaturação. Foi objectivo do presente trabalho seguir as alterações conformacionais e funcionais promovidas pela proximidade do TFE à estrutura da cardosina A. A dependência da função enzimática em relação à estrutura proteica foi relacionada com a disponibilidade de água e/ou de pontes de hidrogénio na superfície da proteína. Diferentes métodos espectroscópicos (dicroísmo circular e fluorescência intrínseca), medições de actividade enzimática, e análise calorimétrica foram utilizados para detectar e caracterizar os estados induzidos pelo solvente orgânico. Finalmente foram aplicadas ao sistema simulações de dinâmica molecular/mecânica molecular (MD/MM) de forma a compreender a interacção entre a proteína e as moléculas de solvente. Os ensaios in vitro com a cardosina A em TFE promoveram variações de folding dependentes da concentração do álcool. Concentrações de TFE inferiores a 4% diminuíram a estabilidade proteica, mas aumentaram reversivelmente a actividade enzimática. Concentrações superiores a 20% de TFE no meio inactivaram irreversivelmente a enzima e desenrolaram a sua estrutura terciária, enquanto o seu conteúdo secundário em hélices foi progressivamente aumentado (principalmente de segmentos sem estruturação prévia). Por último, concentrações superiores a 70% de TFE no meio inactivaram a enzima e promoveram um vasto aumento na complexidade estrutural, na forma típica de estruturas helicoidais abertas, alterações estas que provaram ser reversíveis. As simulações de MD com TFE e água, descreveram alterações locais de flexibilidade proteica, mas sem grandes transformações conformacionais. Em vez disso o modelo expôs os locais de competição entre o TFE e as moléculas de água da superfície de solvatação. Moléculas de TFE foram encontradas a substituir várias moléculas de hidratação no local activo. Apesar da molécula de água catalítica não ter sido perdida na última conformação adquirida na simulação para alto conteúdo em TFE, o local activo apresentava-se ocupado por várias moléculas de TFE, e este facto foi proposto como justificação para a perda de actividade. A mesma lógica poderá explicar a recuperação de actividade após a diluição para sistema aquoso, com a libertação do local activo para interacção com o substrato.The study of aspartic proteases has been gaining interest due to their importance in the development of major concerning human diseases, as Alzheimer’s disease, breast cancer, or AIDS. The molecular basis of some of these diseases is associated to folding errors, which disables proteins proper functioning. Stability studies over this class of enzymes are extremely important for characterising the pathology involved mechanisms and to discover therapeutic solutions. The heterodimeric cardosin A is a plant aspartic proteinase of high yield purification. Besides having been traditionally used as milk clotting agent for cheese making, its characteristics have made it an interesting enzyme for biotechnological applications. This endopeptidase has thus been considered a good model for structural and functional studies of the aspartic proteinases group, and of proteins in general. Water availability is a fundamental factor for protein stability and conformation flexibility, and these characteristics are imperative for proper functioning. The present approach intends to upgrade the understanding of aspartic proteases native conformation as a mutable form. Along the last few years, cardosin A structural conformation has been characterized in biphasic systems, aqueous solutions saturated by organic solvents, and more extensively in the presence of the organic solvent acetonitrile. In sequence with the work developed by our group, the unfolding of cardosin A was here induced by 2,2,2-trifluoroethanol (TFE), a polar and protic organic solvent with very different properties from the previous organic solvents tested. TFE characteristics promote distinct alterations in water structure, interacting in a particular way with the protein hydration layer and with the protein structure itself. Furthermore, it is known to stabilize well ordered conformations rather than inducing denaturation. The aim of the present work was to follow the conformational and functional alterations promoted by TFE proximity to cardosin A structure. The function dependence on enzyme structure was related to the availability of water and/or of hydrogen bonds to the protein surface. Different spectroscopic methods (circular dichroism and intrinsic fluorescence), activity measurements, and calorimetric analysis were employed to detect and characterize the organic solvent induced states. Finally, molecular dynamics/molecular mechanics (MD/MM) simulations were applied to the system in order to understand the interaction between protein and solvent molecules. The TFE in vitro assays with cardosin A promoted folding variations dependent of the alcohol concentration. TFE medium content below 4% decreased protein stability, but reversibly increased its enzymatic rate. TFE medium content over 20%. irreversibly inactivated the enzyme and unfolded its tertiary structure, while secondary helical content was progressively increased (mainly from previously unordered segments). At last, TFE medium content over 70% inactivated the enzyme and promoted a vast increase in structural complexity, taking form as characteristic open helical structures, and these alterations proved to be reversible. MD simulations with TFE and water described local alterations in protein flexibility, but no large conformational transformations. Instead, the model described an exposition of local competition of TFE with water for solvation surface. TFE molecules were found replacing several hydration molecules in the active site. Despite the catalytic water was not lost in the last acquired conformation of the high TFE content MD simulation, the active site was occupied by several TFE molecules, and this occurrence was proposed to justify the activity loss. The same reasoning can explain the activity recovery upon aqueous dilution, with the release of the active site for substrate binding.Fundação para a Ciência e a Tecnologia, Portugal (projecto POCTI/QUI/60791/2004 e bolsa de doutoramento SFRH/BD/10754/2002

One person, two bilateral symmetrical giant Becker nevi

Becker nevus, first described by Samuel William Becker in 1949, is a focal epidermal hypermelanotic disorder. It commonly presents as a unilateral hyperpigmented patch that is predominantly distributed on the upper trunk and proximal extremities and frequently associated with hypertrichosis. There have been few reports in the literature of Becker nevus with bilateral involvement; multiple Becker nevi is also unusual. Herein, we report a young man with two bilateral symmetrical giant Becker nevi, one on the trunk with extension to both arms and the second on the abdomen

One person, two bilateral symmetrical giant Becker nevi

Becker nevus, first described by Samuel William Becker in 1949, is a focal epidermal hypermelanotic disorder. It commonly presents as a unilateral hyperpigmented patch that is predominantly distributed on the upper trunk and proximal extremities and frequently associated with hypertrichosis. There have been few reports in the literature of Becker nevus with bilateral involvement; multiple Becker nevi is also unusual. Herein, we report a young man with two bilateral symmetrical giant Becker nevi, one on the trunk with extension to both arms and the second on the abdomen

Myopericytoma presenting as a painful dark subungual discoloration

Myopericytoma is an uncommon benign neoplasm that arises from the perivascular myoid cells. It typically presents as a painless well-circumscribed cutaneous or soft-tissue nodule, most commonly on the extremities of adults. Histologically, it is characterized by spindle-shaped myoid-appearing cells with a concentric arrangement in vessel walls, that are immunoreactive to alpha-smooth muscle actin and often for h-caldesmon, but negative for other smooth muscle markers. Herein, we present an unusual case of a painful subungual myopericytoma presenting as a dark subungual discoloration

Schwannoma Cutâneo Antigo do Pavilhão Auricular

Schwannoma is a benign encapsulated nerve sheath tumor composed of Schwann cells, that may arise anywhere along the course of a nerve. Cutaneous schwannomas, associated with peripheral nerves, usually present as a slow-growing well-circumscribed nodule, localized in the dermis or subcutaneous tissue. They are generally asymptomatic; however, they may become painful by the nervous compression. Since the clinical signs are non-specific, histology is required for a definitive diagnosis. Herein, we present a case of a solitary cutaneous ancient schwannoma of the ear, a histopathological variant of schwannoma with distinctive morphological characteristics.O schwannoma é um tumor benigno encapsulado da bainha nervosa composto por células de Schwann, que pode surgir em qualquer lugar ao longo do curso de um nervo. Schwannomas cutâneos, associados a nervos periféricos, apresentam-se geralmente como nódulos solitários bem delimitados de crescimento lento, localizados na derme ou tecido celular subcutâneo. Apesar de geralmente assintomáticos, estes tumores podem tornar-se dolorosos pela compressão nervosa. Os seus sinais clínicos são inespecíficos, pelo que a histologia é necessária para o diagnóstico definitivo. Apresentamos um caso de schwannoma cutâneo antigo solitário do pavilhão auricular, uma variante histopatológica de schwannoma com características morfológicas distintivas